생체고분자, 단백질(protein) = 아미노산 중합체
⑴ 특성
① 구성원소 : C, H, O, N, S
② 기능
○ 대사작용의 효소
○ 세포 내·외 구조 형성 : 생체 건량의 반을 차지
○ 근육 수축
○ 면역 기능
○ 호르몬이나 신호 단백질
○ 세포 내부로 신호전달
○ 막의 물질수송
○ 에너지 전환 및 저장 : 4 kcal/g. 주로 태아에 해당
○ DNA 복제, 수선 및 재조합
○ 전사, 번역
○ 단백질 운반 및 분비
③ 단백질 : 한 개 또는 두 개 이상의 폴리펩티드로 구성
④ 폴리펩티드 : 아미노산의 펩티드 결합으로 구성
⑤ 펩티드결합 : 아미노기(-NH2)와 카르복실기(-COOH)의 탈수축합반응
⑵ 아미노산
① 아미노산은 총 20개가 있음 : selenocysteine (Sec)까지 포함하여 21개로 보기도 함
② 구조 : 중심 탄소, 아미노기, 카르복실기, R기
③ 모든 아미노산은 동일한 등뼈를 가지고 있지만 촉쇄군(R로 표시)은 20가지 종류가 있음
○ 그 외는 단백질 합성 ×
○ selenocysteine 등 minor한 아미노산을 합치면 그 개수가 20가지를 초과할 수 있음
④ 양쪽성 이온 : 산 또는 염기로 작용. 등전점
⑤ 아미노산은 곁가지에 따라 성질이 달라짐
○ 비극성 아미노산 : Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Gly
○ 극성, 비전하 아미노산 : Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr
○ 전하 아미노산 (+) : Arg, His, Lys
○ 전하 아미노산 (-) : Asp, Glu
○ -OH기 포함 아미노산 : Ser, Thr, Tyr, -OH기에 인산기가 첨가될 수 있어 신호전달에 이용
○ Ser, Thr : 신호전달에서 인산화 연쇄에 관여
○ Tyr : 신호전달에서 티로신 인산화효소 수용체에 존재
○ 황 포함 아미노산 : Cys, Met. Cys만 이황화결합 형성
○ 페닐기 포함 아미노산 : Phe, Trp, Tyr
○ 페닐기는 280 nm 흡광도를 보임. UV spectrometer 정량의 메커니즘이 됨
○ TCA cycle 미사용 아미노산 : Leu, Lys
⑥ 아미노산의 적정
○ 각 아미노산 별 pKa1, pKa2, pKaR, pI, 소수성 지표, 단백질에서의 비율과 관련
⑶ 단백질 1차 구조(the primary structure)
① 아미노산 서열
② 펩티드 결합의 평면속성(planar nature)
○ amide plane : 하나의 펩타이드 결합을 이룸. 2개의 알파 탄소와 그 사이의 C, O, N, H가 이루는 평면
○ 한 평면 내 여러 결합의 명칭
○ Φ 결합 : N - Cα 결합
○ ψ 결합 : Cα - C 결합
○ ω 결합 : C - N 결합
○ χ 결합 : Cα - R(작용기) 결합
○ C=O 결합은 ω 결합과 공명하면서 C=O 결합과 C-N 결합은 1.5중결합이 되어 회전이 안 되고 고정됨
⑷ 단백질 2차 구조(the secondary structure)
① 아미노산의 등뼈 간의 수소결합 (H와 O)에 의해 아미노산 서열이 입체적으로 휘는(coiling or folding) 구조
② 알파나선(α helix)
○ N 번째 아미노산의 C=O 결합과 N+4번째 N-H 결합이 수소결합을 구성
○ 실제 평균은 3.6 residues per turn (단, 편차가 있음)
○ 탄력 우수, 오른나선
○ 친수성 아미노산은 인력 및 척력이 있어 알파나선 형성을 방해함
○ 알파나선은 소수성 아미노산이 주로 형성
○ 막관통 단백질에서 자주 관찰
○ Gly : 작용기 R이 수소이기 때문에 크기가 작아 알파나선 구조를 생성하기 부적절
○ Pro : 이미노기를 형성하여 수소결합 제한 → 알파나선 구조 미형성
③ 베타병풍(β pleated sheet) : 지그재그(zig zag) conformation이라고도 함
○ 특징 : 아미노산 내 수소결합뿐만 아니라 아미노산 사슬 간의 수소결합도 존재함
○ 실크와 같은 섬유성 단백질에서 자주 나타나는 구조
○ 거미줄은 β 병풍 구조에 α 나선이 첨가된 구조
④ 라마찬드란 조사구(Ramachandran plot)
○ Φ 결합을 가로축, ψ 결합을 세로축으로 도시한 2차원 입체구조 표시 방법
○ 알파나선 구조는 (-60°, -60°)에 집중 분포. 베타병풍 구조는 (-120°, 120°)에 집중 분포
○ 용도 : 잔기가 적절한 위치에 있는지 보는 것. 조사구 상에 섬이 많으면 적절한 위치에 없는 것
○ 예시
⑸ 단백질 3차 구조(the tertiary structure)
① 폴리펩타이드의 전체 입체구조
② R기 간의 상호작용으로 인해 서로 다른 입체구조를 갖게 됨. 입체구조의 차이는 성질의 차이를 결정
③ 이온결합(ionic bond)
④ 공유결합(covalent bond)
⑤ 이황화결합(disulfide bridge) : 입체구조가 보다 단단하게 고정될 수 있음
○ 환원제 : 이황화결합을 자름. β-mercaptoethanol, DTT(dithiothreitol) 등
○ 진핵세포는 조면소포체에서. 원핵세포는 세포질에서 PDI(protein disulfide isomerase)가 형성
○ 안핀센 실험(Anfinsen's experiment)
○ NEM(N-ethylmaleimide) : 이황화결합에 참여하지 않는 시스테인의 -SH기에 공유결합
○ DTT(β-metcaptoethanol 포함) : -S-S- → -SH + HS-. 이황화결합을 끊는 환원제로 기능. 글루타티온(GSH)도 유사 기능
○ NEM* → DTT → NEM : 처음에 SH기로 존재했던 것 정량. 단 *는 방사성 동위원소
○ NEM → DTT → NEM* : 처음에 -S-S-로 존재했던 것 정량. 단 *는 방사성 동위원소
○ 결론 1. 단백질의 변성요인이 제거되면 단백질은 원래 구조를 찾아감
○ 결론 2. 이황화결합은 입체 구조 생성에 비가역적으로 기여하기 때문에 섬세하게 조절돼야 함
⑥ 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) : 생체 환경이 물이기 때문에 발생한 힘
⑦ 극성 결합 및 R기 간 수소결합
⑧ 반데르발스 힘(van der Waals force)
⑨ 기타 상호작용
○ C=O 결합의 유사 수소결합 : n → π*, 단백질 잔기의 45% 이상
○ π-π stacking : aromatic ring stacking
○ 입체장애(steric hindrance)
○ C5 hydrogen bonds in β-sheet backbone
○ cation-π interaction
⑩ 특정 상호작용이 강해서 단백질이 잘못 접힐 수 있어 샤페로닌(chaperone) 등의 단백질 조립 단백질 필요
○ 예 1. heat shock protein : 온도에 의해 단백질이 변성되는 것을 막아줌
⑹ 단백질 4차 구조(the quaternary structure) : 3차 구조 폴리펩타이드 간 상호작용
① transthyretin(4 합체), 헤모글로빈(α2β2), 콜라겐(3 helix)
⑺ 단백질 구조 결정법
① 1차 구조의 결정
○ 방법 1. 에드만 시약(Edman degradation)
○ 약알칼리에서 폴리펩티드 N말단에 결합하여 아미노산을 하나하나씩 분해함
○ N-terminal에서 약 10개 정도의 아미노산만 알 수 있음
○ 굉장히 전통적인 방법으로 현재는 거의 쓰고 있는 사람이 없음
○ 방법 2. 펩티데이스
○ 엔도펩티데이스와 엑소펩티데이스를 적절히 조합하여 아미노산을 적절하게 분해하여 하나씩 결정
○ 엔도펩티데이스 : 펩신, 트립신, 키모트립신 등
○ 엑소펩티데이스 : 카르복시펩티데이스 등
○ 펩티데이스의 메커니즘
○ 방법 3. Ab array
○ 방법 4. mass spectrometry
○ 1st. electrophoresis & DNA ladder : pure인지 mixture인지 알 수도 있음
○ 2nd. 트립신 처리
○ 3rd. 1차 mass spectroscopy : MS spectrum 구성
○ 4th. 2차 mass spectroscopy : MS/MS spectrum 구성. tandem MS, MS/MS, fragmentation이라고도 함
○ 5th. 스펙트럼을 통한 재구성 : informatics의 영역
○ 위 방법은 1세대 기술로서 post-translational modification을 고려하면 훨씬 절차가 복잡해짐
② 2차 구조의 결정
○ 방법 1. 원형편광이색성(circular dichroism, CD)
○ 방법 2. 적외선 분광법 : 유연한 펩타이드 및 단백질 구조를 조사할 때 유용
○ 방법 3. 분자동역학 시뮬레이션
③ 3차 및 4차 구조의 결정
○ 방법 1. X-ray crystallography : 약 90%가 이 방법으로 결정됨. 원자들의 3차원 좌표를 유추할 수 있음
○ 방법 2. NMR : 약 9%가 이 방법으로 결정됨
○ 방법 3. cryo-EM
○ 해상도가 낮지만 꾸준히 발전하고 있으며 캡시드, 아밀로이드와 같은 큰 단백질 복합체에 유용함
○ -200 ℃로 온도를 낮춰서 단백질을 정지시킨 뒤 단백질의 3D 구조를 관찰
⑻ 단백질 변성(denaturation)
① 변성(denaturation) : 염의 농도, pH, 고온 등으로 입체구조가 달라져서 기능을 상실