노벨 생리·의학상, ’24시간 생체시계’ 비밀 연구
미 과학자 3명, 밤에 졸리고 아침에 깨는 원리 밝혀
스웨덴 카롤린스카의대 노벨위원회는 생체시계의 비밀을 밝혀낸 미국의 과학자 3명에게 2017년 노벨 생리·의학상을 수여한다고 밝혔다.
3명의 수상자는 미국 메인대의 유전학자 제프리 C 홀(Jeffrey C Hall, 72) 교수, 브랜데이스대의 마이클 로스바시(Michael Rosbash, 73) 교수, 록펠러대의 마이클 영(Michael W Young, 68) 교수 등 3명의 유전학자들이다.
사람을 비롯한 동·식물 세포 안에는 생리현상을 주관하는 생체 리듬, 즉 시계와 같은 메커니즘이 작동하고 있다. 인간의 경우 세 메커니즘이 작동하고 있는데 체온 변화와 같은 ‘하루보다 짧은 주기’, 낮과 밤에 따른 ‘24시간 주기’, 여성 생리 등 ‘하루보다 긴 주기’가 그것이다.
3명의 수상자는 세 주기 중 하루 동안의 주기적 변화를 의미하는 ‘서캐디언 리듬(circadian rhythm)’을 집중적으로 연구해왔다. ‘서카디안 리듬’이란 라틴어로 ‘circa(근처에란 뜻)’와 ‘day(하루)’를 합성한 단어로 ‘24시간 주기’를 말한다.
이를테면 식사를 언제 해야 할지, 또는 언제 자고 언제 일어나야 할지 등을 주기적으로 알려주는 기능을 말한다. 노벨위원회에 따르면 이들 3명의 과학자는 초파리에게서 생체 리듬을 컨트롤하는 유전자를 분리하는데 성공했다.
그리고 이 유전자 신호에 따라 주기적으로 밤에는 세포 내 분자가 축적되고 있으며, 또 낮에는 분해되고 있다는 사실을 확인했다. 수상자들은 이어 세포 안에서 스스로 움직이는 시계 태엽(self-sustaining clockwork)과 같은 생체시계 메커니즘을 발견했다.
이 메커니즘은 또한 사람을 비롯한 다른 생체 세포구조 속에서도 같은 원리에 따라 움직이고 있었다. 이 생체시계는 매일매일 매우 정교하게 작동하면서 생물 세포 안에서 놀라운 정도로 다양한 생체 리듬을 만들어내고 있었다. 또 행동(behaviour)을 비롯 호르몬 분비량, 수면, 체온, 신진대사 등에 이르기까지 생리작용 전반을 통제하고 있었다. 이는 사람이 습관적으로 생체시계를 자주 거스를 경우 건강을 크게 해칠 수 있다는 것을 의미한다.
예를 들어 잦은 비행기 여행으로 시차증을 자주 경험할 경우 불균형에 의한 다양한 질병을 유발할 수 있다. 생체시계에 비밀을 처음 감지한 사람은 18세기 천문학자 장-자크 도르투 드 메랑(Jean Jacques d’Ortous de Mairan)였다.
그는 식물 ‘미모사’가 낮에는 태양을 향해 잎을 펼치고 있다가 어두워지면 잎을 오무린다는 사실에 주목했다. 미모사가 계속 어두운 환경에 노출되면 어떤 변화를 보일지 궁금했던 그는 햇빛을 차단시킨 후 미모사 움직임을 관찰했다.
세포 안에서 24시간 주기 생체리듬 컨트롤
그리고 햇빛이 없어도 잎들은 일상적인 밤낮의 주기에 따라 움직인다는 사실을 발견했다. 식물에 생체시계가 돌고 있다는 최초의 증명이었다. 이후 다른 과학자들은 사람을 비롯한 동·식물 대상의 연구를 진행했고 세포 안에서 생체시계가 돌고 있다는 사실을 확인했다.
수상자들은 이어 세포 안에서 수면 조절, 호르롬 분비 등과 같은 스스로 움직이는 시계태엽(과 같은 생체시계 메커니즘을 발견했다.
3명의 수상자들은 새로운 발상을 통해 세포 안에서 수면 조절, 호르롬 분비 등과 같은 스스로 움직이는 시계태엽과 같은 생체시계 메커니즘을 발견했다.
과학자들은 이 메커니즘을 ‘서카디안(circadian) 리듬’이라고 명명했다. 그리고 약 200여년에 걸쳐 이 메커니즘이 발생하는 원인을 알아내려 했지만 그 비밀이 밝혀지기 시작한 것은 1970년대 들어 유전자 연구를 시도하면서부터다.
미국의 분자생물학자였던 캘리포니아공과대학의 세이무어 벤저(Seymour Benzer) 교수 연구팀은 사람의 유전자와 매우 유사한 초파리 유전자가 세포 안에서 24시간 주기 ‘서카디안 리듬’을 컨트롤하고 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
이들은 어떤 돌연변이 유전자가 24시간 내내 초파리의 ‘서카디안 리듬’을 방해하고 있다는 사실을 알아냈다. 벤저 교수 연구팀은 생체시계 리듬을 잃어버리게 한 초파리 유전자를 ‘PER(period의 줄임말)’이라고 불렀다.
그러나 24시간 내내 ‘서카디안 리듬’을 방해하고 있는 돌연변이 유전자가 어떤 과정을 통해 어떤 활동을 하고 있는지는 밝혀내지 못하고 있었다. 이 수수께끼를 풀어준 사람들이 올해 노벨상을 수상한 3명의 과학자들이다.
이들은 1984년 초파리 세포 안에서 PER 유전자를 분리해내는데 성공했다. 이어 제프리 홀 교수와 마이클 로스바시 교수는 이 유전자에 의해 암호화된(encoded) ‘PER 단백질’을 찾아냈으며, 이로 인해 24시간 주기적으로 활동을 통제받고 있다는 사실을 발견했다.
PER에 영향을 받은 단백질이 밤이 되면 축적됐다가 낮 시간에 다시 분해되면서 세포활동을 조절하고 있었다. 이 과정을 확인한 3명의 과학자들은 현재 이 ‘서카디안 리듬’이 어떤 과정을 통해 어떻게 지속적으로 가동되고 있는지 후속 연구를 이어갔다.
제프리 홀 교수와 마이클 로스바시 교수는 ‘억제 피드백 고리(inhibitory feedback loop)’에 의해 ‘PER 단백질’이 자신의 합성을 막을 수 있으며, 그 결과 지속적이면서 주기적인 일주 리듬을 스스로 조절할 수 있다고 추론했다.
“생체시계 원리로 웰빙·건강 연구 가능해져”
이어 두 교수는 후속연구를 통해 PER 단백질이 유전물질이 들어 있는 세포핵 안에 도달해 있는 것을 발견했다. 그러나 이 단백질이 어떤 식으로 유전물질을 자극하고 생체시계에 영향을 미치고 있는지 알아내지 못하고 있었다.
이 궁금증을 풀어준 사람이 마이클 영 교수다. 그는 1994년 PER 유전자에 TIM(timeless의 줄임말) 유전자가 결합해 있는 것을 발견했다. PER 단백질이 세포핵에 들어갈 수 있었던 것은 PER 유전자가 TIM 유전자와 결합했기 때문.
이런 과정을 거쳐 세포핵 도달한 ‘PER 단백질’은 ‘억제 피드백 고리(inhibitory feedback loop)’에 의해 자신의 합성을 차단할 수 있었다. 이 과정은 세포 내에서 단백질에 어떤 변화가 일어나고 있는지 말해주고 있었다.
그러나 24시간 주기로 변화하는 생체 리듬과 관련 의문이 풀리지 않고 있었다. 이 역시 마이클 영 교수가 해결했는데 ‘DBT(doubletime의 줄임말) 단백질’이 PER 단백질의 축적에 영향을 미친다는 사실을 발견했다.
이 발견은 특정 유전자 활동이 24시간 주기 ‘서카디안 리듬’에 어떤 영향을 미치고 있는지 상세히 말해준다. 노벨상위원회는 “이들 세 과학자가 패러다임 전환을 통해 생체시계가 작동하는 핵심 원리를 발견할 수 있었다.”고 치하했다.
또한 “인간의 복잡한 생리구조를 감안했을 때 이 원리를 활용해 생체시계와 관련된 또 다른 분야의 중요한 연구들을 이끌어내고, 또한 건강과 웰빙(wellbeing)을 위한 기초를 놓을 수 있을 것”으로 전망했다.
한편 3명의 수상자 중의 한명인 로시바스 교수는 수상직후 이루어진 노벨상위원회와의 전화 인터뷰에서 “농담을 하고 있느냐”는 질문과 함께 겸손한 모습을 보였다. 영 교수는 “아직 1%밖에 밝혀낸 것에 불과하다”며 강한 연구 의욕을 보였다.
연구 결과 개요
1. 연구배경
지구의 자전으로 생기게 되는 빛, 어둠, 온도와 같은 일주기성을 가지는 외부 자극에 대응하기 위해 여러 생명체들은 일주기성 생체리듬 (circadian rhythm)을 가지고 있다. 2017년 노벨 생리의학상이 대표적 모델 시스템인 초파리를 이용한 생체시계 연구자들에게 주어졌다. 일주기성 생체리듬은 페이스메이커 역할을 하는 주요 생체시계 신경 세포 내의 유전자 시계에 의해서 유지된다. 기존 연구들은 분자적 생체시계를 구성하는 유전자의 기능에 주로 집중되었다. 생체시계 신경 세포로부터 시간에 대한 정보가 행동으로 전달되는 과정에 대해서는 상대적으로 적게 알려져 있다.
2. 연구내용
12시간 주기의 빛/어둠에서 생체 시계를 동조화(entrainment) 시킨 후 연속적인 어둠 상태에 있는 초파리는 수평이동 가능한 유리관 내에서 하루 주기의 운동성을 보인다. 이러한 일주기성 행동의 변화를 보이는 돌연변이를 찾기 위해 스크리닝을 진행하였고, 비정상적인 일주기성 행동을 보이는 Tango10 (Transport and Golgi organization 10) 유전자 돌연변이를 찾았다(그림 1).
결실 돌연변이체와의 상보성 테스트, 성체 시기 특이적으로 Tango10 유전자의 발현을 회복 후 행동 관찰 등 다양한 유전학 실험을 통해서 성체 시기에서 Tango10 유전자의 발현이 일주기성 행동 유지에 중요하다는 것을 확인하였다. RNA 저해를 이용해 생체 시계 세포 특이적으로 Tango10의 발현을 낮추게 되면 돌연변이와 유사하게 활동의 주기성 약화가 관찰되었다. 이는 Tango10의 생체 시계 세포 내 발현이 일주기성 행동에 필요하다는 점을 나타낸다.
면역형광법(immunoflourescence assay)을 통해 생체 내 시계를 구성하는 주요 생체 시계 유전자인 PERIOD(PER)와 TIMELESS(TIM)의 단백질 발현을 알아보았다. PER, TIM 단백질 발현이 줄어들어 있었지만, 24시간 주기의 리듬은 유지되고 있음이 Tango10 돌연변이에서 관찰되었다. 이는 Tango10이 생체시계 유전자 발현과 일주기성 동물행동을 연결하는 경로에서 작용할 가능성을 제시하였다.
페이스메이커 역할을 하는 생체시계 세포의 정보는 PDF (Pigment-dispersing factor)라는 신경조절 펩타이드에 의해 전달된다. Tango10 돌연변이는 생체시계 신경 세포의 축삭돌기 말단에서 보이는 PDF 발현의 하루 주기 리듬이 사라진 축적된 양상을 보였다(그림 2). 이러한 변화가 분자적 생체시계 이상 때문인지 확인하기 위해, timeless 유전자가 없을 때 Tango10의 PDF 축적에 대한 영향을 살펴보았다. 이 경우 여전히 축삭돌기 말단에서의 축적이 관찰되었다. 이는 Tango10이 PDF를 통해 생체 시계 정보를 전달하는 과정에 작용함을 보여준다. PDF 신경 펩타이드의 분비뿐만 아니라 생체리듬 세포의 축삭돌기 가지(axon branching)는 확장/수축하는 구조 변화의 주기성을 보인다. Tango10이 망가지면 이러한 신경 가소성의 리듬 또한 보이지 않았다.
생체시계 신경 세포에서 과발현된 Tango10은 축삭돌기 말단에서 일주기적인 발현 리듬을 보였다. 이는 Tango10의 발현이 생체 시계의 영향을 받는다는 점을 나타낸다. 면역침강(immunoprecipitation)을 통해 생체시계 신경 세포에서 발현된 Tango10 단백질 복합체를 분리정제한 후 질량 분석(mass spectrometry)을 통해 단백질에 유비퀴틴을 표지하는 효소인 Cullin3와 Tango10 단백질이 결합한다는 사실을 밝혔다. 생체시계 신경 세포 특이적으로 Cullin3의 발현을 저해하면 Tango10의 경우와 유사하게 일주기성 행동의 주기성이 사라지고, timeless 유전자의 여부와 관계없이 생체시계 신경세포의 축삭돌기 말단에서 PDF 과축적이 관찰되었다. Tango10은 Cullin3 효소 복합체의 어댑터(길잡이 단백질)로 작용하여 Cullin3 효소와 유비퀴틴화 되는 기질 단백질(분해될 대상이 되는 단백질)을 연결시켜줌으로써 생체 리듬 조절에 작용할 것으로 생각된다.
생체시계 신경 세포 축삭돌기 말단의 PDF 축적은 신경 세포의 흥분성(excitability)과 관련되어 있기 때문에, 전기생리학을 통해 Tango10의 영향을 조사하였다. PDF를 발현하는 large ventral lateral neurons (l-LNvs)는 전세포 패치 클램프 (whole-cell patch clamp)에서 Tango10 돌연변이에서는 세포 흥분성이 증가되어 있었다. 낮과 밤 시간 모두 생체 시계의 발화 빈도 (firing rate)가 Tango10 돌연변이에 의해서 늘어나 있었다 (그림 3). Tango10에 의한 흥분성 조절의 원리를 규명하기 위해서, 전압 클램프(voltage clamp)를 진행했다. Tango10 돌연변이는 빠른 비활성화를 보이는 전압 의존적 K+ 외향성 전류 (voltage-gated potassium outward current with fast inactivation)가 줄어들어 있었다. 테트로도톡신(tetrodotoxin, TTX)을 사용하여 Na+ 이온 채널을 차단한 후, K+ 이온 채널 차단제인 테트라 에틸 암모늄 (tetraethylammonium, TEA) 처리시 Tango10에 의한 전류 변화는 관찰되지 않았다. 하지만, TTX와 TEA 동시 처리 후 K+ 이온 채널 차단제, 4-아미노피리딘 (4-aminopyridine, 4-AP)를 처리하면 전류 감소가 Tango10 돌연변이에서 관찰되었다.
이러한 Shaker-like IA전류 감소가 Tango10 돌연변이의 시계 신경 세포 흥분성 증가를 설명할 수 있는지 알아보기 위해서, l-LNv 전기 생리학에 관한 새로운 수학적 모델을 만들었다. 이 모델의 시뮬레이션 시 Shaker/Shal 전류의 30% 감소와 Tango10 돌연변이의 발화 빈도 증가가 재현 되었다.
종합하면, 일주기성 생체 리듬을 만들어내는 분자시계에 의해 발현이 조절되는 Tango10은 Cullin 3 유비퀴틴화 효소의 어댑터로 작용하여 Shaker/Shal과 같은 K+ 이온 채널을 통해 생체시계 신경 세포의 흥분성을 제어한다. 이 신경세포 흥분성에 따라 페이스메이커 신경 세포의 시간 정보를 전달하는 신경조절 펩타이드인 PDF 분비가 조절됨으로써 일주기성 행동을 유지한다는 새로운 생체리듬 조절 모델을 제시하였다 (그림 4).
3. 기대효과
생체시계 신경 세포가 가진 분자시계에 의해서 만들어진 하루 주기의 시간 정보가 어떠한 경로를 거쳐 시계 신경 세포의 활성 및 가소성 리듬, 개체의 행동으로 나타나는지에 대해 상세히 밝혔다. 이러한 결과는 분자시계와 일주기성 생리현상을 연결하는 경로에 대한 후속 연구에 중요한 단서로 사용될 것이다. 일주기성 생체 리듬 이상으로 나타날 수 있는 수면관련 질환들의 원인 규명과 치료기술 개발 연구에 시계 신경 세포 활성 조절과 같은 방법이 응용될 수 있을 것이다.
12시간 주기의 빛/어둠 조건 (LD)과 연속적인 어둠 상황(DD)에서 정상 초파리(wild-type)와 Tango10 돌연변이 초파리(Tango10 GG, Tango10 bsr)의 움직임을 비교 분석함. 외부자극 없이 개체의 내재적인 생체 시계만으로 동물행동의 주기성이 유지되는 DD 조건에서 Tango10 돌연변이는 불규칙적인 행동 주기를 보임.
12시간 주기의 빛/어둠 조건에서 정상 초파리(WT)와 Tango10 돌연변이 초파리의 생체시계 신경 세포 축삭돌기 말단의 신경 펩타이드 PDF 발현 양상을 면역 형광법을 통해 검사함. 일주기성 발현을 보인 정상 초파리와 달리 Tango10 돌연변이의 경우 페이스메이커 신경세포의 축삭돌기 말단에서 비정상적인 PDF 축적에 의한 일주기성 분비 장애가 관찰됨 (ZT0, 빛/명주기 시작; ZT12, 어둠/암주기 시작).
whole-cell patch 전기생리학 기법을 이용하여 생체시계 신경 세포의 활성을 측정함. 생체시계 신경세포 가운데 실험에 사용된 large ventral lateral neuron의 경우 밤보다는 낮 시간 동안 발화 빈도가 높으나, Tango10 돌연변이 신경세포의 경우 전반적으로 흥분성이 증가되어 있음.
24시간 주기 유전자 발현 조절을 통해 분자시계를 작동하는 생체시계 유전자들은 생체시계 신경세포 축삭돌기 말단에서의 유비퀴틴화 효소 단백질 복합체인 ‘Tango10-Cullin 3’의 발현을 조절함. Tango10은 Shaker/Shal과 같은 K+ 이온 채널을 통해 생체시계 신경 세포의 흥분성을 제어하고, 생체시계 신경조절 펩타이드인 PDF의 일주기성 분비를 조절함. Tango10은 단백질 유비퀴틴화 기능을 통해 분자시계와 일주기성 신경 가소성간을 연결함으로써 24시간 주기의 동물행동을 조절함.